Ви є тут

Головна » БТФ №1 2023

Порівняльний аналіз методів виділення ДНК із різних тканин риб

Екстракція нуклеїнових кислот є початковим етапом молекулярно-генетичних досліджень. Ефективність застосування певної методики виділення ДНК визначається кількістю екстрагованої ДНК, ступенем деградації препарату, загальною тривалістю та трудомісткістю процедури. Під час досліджень рідкісних зникаючих видів і популяцій особливу увагу приділяють виділенню ДНК із джерел, які не спричиняють руйнувань чи загибелі організму. Метою дослідження було порівняння ефективності найбільш поширених методів виділення геномної ДНК із тканин риб для подальшого використання в полімеразній ланцюговій реакції – методу фенол-хлороформної екстракції, методу сольової екстракції та методу екстракції з перхлоратом натрію. Матеріалом для досліджень слугували зафіксовані в етанолі проби плавців, печінки та ікри, відібрані у особин стерляді. Дослідження впливу якості препарату ДНК на перебіг ПЛР проводили за використання двох видів ПЛР – сайт-специфічної, ампліфікуючи фрагмент гена cytochrome-b, та мультилокусної – ISSR-PCR з тринуклеотидним праймером (AGC)6T. Порівняння методик екстракції ДНК підтвердило, що всі вони уможливлюють отримання якісних препаратів ДНК як із свіжих, так і з архівних проб тканин риб для проведення сайт-специфічної ампліфікації. Вихід нуклеїнових кислот за використання різних тканин риб (плавців, печінки та ікри) неоднаковий, тому, коли необхідно отримати максимальну кількість ДНК, доцільно застосовувати методику сольової екстракції. У випадку мультилокусної ампліфікації, зокрема ISSR-PCR, різний ступінь очищення ДНК впливав на перебіг процесу ампліфікації. Додаткове очищення методом сорбції на силіцій оксиді дає змогу позбутися можливих інгібіторів ПЛР і отримати чіткі спектри електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації, незважаючи на якість первинного препарату ДНК.

Ключові слова: методи виділення ДНК, плавці, печінка, ікра стерляді, сайт-специфічна ПЛР, мультилокусна ПЛР.

ДИМАНЬ Т.М. https://orcid.org/0000-0002-6428-1476


ШОСТАК Л.В.


ДУБІН О.В.


ДИМАНЬ Н.О.


  1. Aljanabi, S. M., Martinez, I. (1997). Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Res., Vol. 25, no. 22, pp. 4692–4693.
  2. Amos, B., Hoelzel, A. R. (1991). Longterm preservation of whale skin for DNA analysis. Rep. int. Whal. Commn. (special issue), no. 13, pp. 99–103.
  3. Appleyard, Sh.F., Maher, S., Pogonoski, J.J., Bent, S.L., Chua, X-Y., McGrath, F. (2021). Assessing DNA for fish identifications from reference collections: the good, bad and ugly shed light on formalin fixation and sequencing approaches. Fish biology, Vol. 98, no.5, pp. 1421‒1432.
  4. Barbosa, C., Nogueira, S., Gadanho, M., Chaves, S. (2016). DNA extraction: finding the most suitable method. Molecular Microbial Diagnostic Methods: Pathways to Implementation for the Food and Water Industries. Chapter 7. Elsevier Inc., pp. 135–154.
  5. Boom, R., Sol, C., Weel, J., Goudsmit, J., Wertheim-van Dillen, P. (1999). Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate DNA Isolation Procedure Based on Selective Binding of Bovine Alpha-Casein to Silica Particles. J. Clin Microbiol., Vol. 37, no. 3, pp. 615– 619. DOI:10.1128/jcm.37.3.615-619.1999.
  6. Brescia, P. (2012). Micro-Volume Purity Assessment of nucleic acids using A260/A280 ratio and spectral scanning. Application Note: protein and nucleic acid quantifcation. AN060112_12, Rev. 06/04/12. BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT. Retrieved from http://www.biotek.com.
  7. Bruyn, M. D., Parenti, L. R., Carvalho, G. R. (2011). Successful extraction of DNA from archived alcohol-fixed white-eye fish specimens using an ancient DNA protocol. J. Fish Biol., Vol. 78, pp. 2074– 2079.
  8. Chowdhury, M. M., Rahman, A. S.M.S., Nahar, L., Rahman, M., Al Reza, H., Ahmed, M. S. (2016). Efficiency of different DNA extraction metods for fish tissues: A comparative analysis. IOSR Journal of Pharmacy & Biologocal Science, Vol. 11, no. 3, pp. 11‒15. DOI:10.9790/3008-1103041115.
  9. Dwiyitno Hoffman, S., Parmentier, K., Van Keer, C. (2018). Method Comparison of DNA Isolation and Quantification for Fish and Seafood Authenticity Determination. Squalen Bull. of Mar. and Fish. Postharvest and Biotech., Vol. 13, no. 3, pp. 115‒124.
  10. Fang, S., Wan, Q., Fujihara, N. (2002). Formalin removal from archival tissue by critical point drying. Biotechnology, Vol. 33, pp. 604‒611.
  11. Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. (1975). Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. FEBS Journal, Vol. 56, no. 1. pp. 103‒108. DOI:10. 1111/j.1432- 1033.1975.tb02211.x.
  12. Kumar, R., Singh, P. J., Nagpure N. S., Kushwaha, B., Srivastava, S. K., Lakra, W. S. (2007). A non-invasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. Ind. J. Exp. Biol., Vol. 45, pp. 992‒997.
  13. LGC. (2018). DNA Quantification: Comparison of UV Spectrophotometry and PicoGreen Analysis. Available at:https://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/services/Extraction/DNAQuan....
  14. Muhammad, H., Iqbal, Z., Iqbal, M. U., Younas, T., Bashir, Q. (2016). An efficient method for DNA isolation from fish fin. Pak. J. Agri. Sci., Vol. 53, no. 4, pp. 843‒850. DOI:10.21162/PAKJAS/16.3998.
  15. Sambrook, J., Russell D. W. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual (3rd Ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 1626 p.
  16. Silva, P. C., Malabarba, M-C., Vari R., Malabarba L. (2019). Comparison and optimization for DNA extraction of archived fish specimens. MethodX, Vol.6, pp.1433‒1442. DOI:10.1016/j. mex.2019.06.001.
  17. Wilcockson, J. (1973). The Use of Sodium Perchlorate in Deproteinization During the Preparation of Nucleic Acids. Biochem. J., Vol. 135, pp. 559–561.
ДолученняРозмір
PDF icon dyman_1_2023.pdf1.85 МБ
БТФ №1 2023